干貨丨且看如何利用梯度洗脫方法一招破解出峰問題--原理篇

我們先來看一張圖

通過一張直觀的圖來探討今天的話題

這三張色譜圖的條件如下：

測試物質(zhì)為C1-C10的烷基胺同系列衍生的衍生的亞奈基苯并咪唑胺黃酰

這三張色譜圖給您的直觀感覺是什么？

●A圖等度洗脫，95：5的甲醇水，10個峰在10min出峰，峰很尖銳（窄），可是基線不分離。

●B圖等度洗脫，80：20的甲醇水，10個峰在50min出峰，后面的峰明顯展寬，峰矮胖。

●C圖梯度洗脫，所有物質(zhì)在20min出峰，分離度和響應(yīng)都良好。

這三張圖看完后，您是否有如下疑問？

●等度洗脫，要么幾個峰分不開，要么分開了，時間長，出現(xiàn)矮胖峰，等度洗脫不適合多組分分離嘛，同行告訴我多組分一般要使用梯度洗脫，這是為什么？

●梯度洗脫是怎么實現(xiàn)化合物在好的分離度下，又保持色譜峰不展寬，出現(xiàn)尖銳的色譜峰的？

●怎么設(shè)置梯度，怎么確定一個好的梯度洗脫方法？

為了解決大家的困惑，

我們今天就是要來探討，

為什么多組分要使用梯度法，

梯度洗脫怎么優(yōu)化。

對于多組分的檢測，我們希望什么？

1、良好的分離度

2、好的響應(yīng)，峰高和峰面積，色譜不展寬，得到窄的色譜峰。

首先，我們來看看影響色譜分離度的因素是什么？

這里給大家放上一個分離度的關(guān)系式：

式子中的R為分離度，k為容量因子，a為分離因子。

我們來回顧一下基本知識：

t_M 為不被固定相保留的死時間，

t_R為化合物的保留時間（從進樣到出現(xiàn)濃度大值的時間），

t_R^’為化合物的調(diào)整保留時間。

容量因子：是化合物在液-固兩相達到分配平衡時，組分在固定相與流動相中的質(zhì)量比值，因此又被稱為質(zhì)量分配系數(shù)。

分離因子：分離因子是在同一色譜系統(tǒng)條件下保留的差異的量度

當(dāng)α=1時，兩個色譜峰具有相同的保留時間并共流出。

對于多組分，我們需的是，在一定的時間內(nèi)將組分分離，并且得到一定的色譜寬度的峰（尖峰）；那么想要良好的分離度，需要的是相鄰的兩個化合物能達到基線分離，首先看一下分離度公式，看看什么影響分離度：

其中：；我們可以看到，在同一色譜系統(tǒng)，兩個化合物的分離因子，與此色譜系統(tǒng)下，化合物自身特性相關(guān)，當(dāng)α越大，分離度也將越大。

而其中：

可見，K’增大，可以提高分離度。

我們知道，梯度洗脫程序在改變流動相的比例，以達到分離的目的，那么梯度洗脫究竟是怎么來影響分離度的呢？

我們以反相色譜系統(tǒng)為例，來看一下，當(dāng)我們改變了流動相比例時，k’的變化情況。

這是一張反相色譜圖中，化合物的lgk’與流動相中有機相比例的關(guān)系圖，近似為線性的關(guān)系圖。從這張圖，可以看出，在反相色譜中，lgk’隨著ψ比例增大，逐漸降低，k’也逐漸減小。

即:  lgk’ =Aψ+B (A為曲線的斜率，B為截距）。

通過這張圖，我們來說明為什么需要梯度洗脫，

對于化合物1，2

Ψ=0.45時，lgk1’ =0.97，k1’=9.33；

lgk2’=1.27,   k2’=18.6;

如果我們使用等度洗脫，有機相的比率為45%，我們會發(fā)現(xiàn)，由于此時的k1’=9.33， k2’=18.6，k’都大于10，這個時候，化合物與固定相作用的時間較長，因此可以想象，在這個時候化合物1，和化合物2 出峰時間都比較靠后，而且由于強的作用力，導(dǎo)致流動相無法在一個短的時間內(nèi)將化合物洗脫出來，因此峰都變得比較矮胖，也就是寬峰，如圖：

對于化合物1，2

Ψ=0.65時，lgk1’ =-0.21，k1’=0.61；

lgk2’=-0.35,   k2’=0.44;

如果我們使用等度洗脫，有機相的比率為65%，我們會發(fā)現(xiàn)，由于此時的k1’=0.61， k2’=0.44，k’都接近于0，此時化合物會被流動相快速帶出，形成尖峰，但由于兩個化合物得K'都很小，而且接近，會形成共流出物，而且，第yi個峰出峰時間hao大于2t_M（K’=0)值，反映得圖如下：

那么如果是梯度洗脫，會怎么樣呢：

在梯度洗脫過程中，K’的值會隨流動相的變化而改變，化合物被流動相洗脫帶出色譜柱到達檢測器的保留時間，與化合物從進樣開始，到流出色譜柱的這一段時間內(nèi)平均的K’的大小，以及色譜柱長，流動相的流速等有關(guān)，而化合物是否能產(chǎn)生窄的色譜峰，則取決于物質(zhì)在將要脫離色譜柱的時候，K’能否比較小（即與固定相的作用力足夠小，能被快速沖洗出去）。

打一個比方：

一輛汽車和一輛摩托車，通過一個長度為Lkm的隧道，汽車初始速度為20Km/h，摩托車的初始速度為35km/h,汽車的加速度為1.5m/s²，摩托車的加速度為0.8m/s²，那么誰將先通過隧道，汽車能否實現(xiàn)超車？

其實如果隧道足夠短，由于初始由于摩托車速度快，雖然加速度小，但是汽車整體的移動速度仍然小于摩托車，汽車的平均速度就小于摩托車的速度，在這個整體水平上，汽車就會比摩托車慢到達，例如：當(dāng)L=100m時，汽車通過的時間為8.42S，摩托車通過的時間為7.78S。

相反，如果隧道足夠長，那么汽車在這段距離上的平均車速就比摩托車快，那么汽車就能實現(xiàn)彎道超車，例如當(dāng)L=1000m時，通過隧道的時間，摩托車為39.3S；而汽車為33S。

這個比方里面的長為L的隧道（不同的隧道長度反映了車子通過隧道的加速時間的長短，導(dǎo)致終通過隧道的平均速度不一樣），這個就相當(dāng)于色譜柱長，初始速度就相當(dāng)于初始流動相比例下的化合物的K’，加速度就相當(dāng)于lgK’與ψ線性曲線的曲線斜率，我們通常說色譜柱柱子長度是一定的，流動相在梯度變化的過程中，在這個時間段內(nèi)，那么相同的柱子長度，K’變化的速率不同（就如同車子的加速度一樣），在整個色譜行為上的平均值K’（如同車子在通過隧道的平均速度V’），就不一樣，如果在梯度變化的時間范圍內(nèi)，通過相同的色譜柱，K’的平均值越小，就越容易先被洗脫出色譜柱，因此我們不能光關(guān)注化合物的初始K’，還需要關(guān)注化合物的K’的變化速率，這就很好的解釋了，為什么有的物質(zhì)在同一根色譜柱上，在A梯度時，化合物X比化合物G先出峰，而在另外一個梯度時，卻是G先出峰（形勢發(fā)生了逆轉(zhuǎn)）。終誰先出峰，與這些因素有關(guān)，另外當(dāng)接近隧道出口時，若汽車速度加到越快（相對于化合物的K’越小），那么汽車或者摩托車整體通過隧道的時間就越短（t=車身長度/車速），對應(yīng)于此時化合物出峰的色譜峰寬度就越窄。

例如，車身長為2.5m，如果終通過隧道時車速為23m/s,則汽車*通過隧道的時間為：0.10S，如果這時候車速為15m/s，則汽車*通過隧道的時間為：0.16S，我們看到，出隧道時，車速越快，車子通過隧道的時間越短，反映在色譜上，就是峰的寬窄了。色譜峰流出的峰寬度反映在色譜圖上的寬度即t₁-t₀。

總結(jié)

1、對于容量因子K’范圍很大的化合物組，分離可以優(yōu)先考慮梯度洗脫。

2、多組分的分離策略，考慮合適的分析時間內(nèi)，得到窄峰和好的分離度

3、梯度洗脫是利用變化的有機相比例，即強度不同，達到改變化合物在兩相中的作用力大小。

4、lg K’與ψ近似線性關(guān)系

5、K’隨ψ的變化趨勢的不同，使得梯度洗脫將不同化合物在色譜上的保留時間差異拉大，甚至出現(xiàn)超車。

6、K’≈0時，化合物幾乎與固定相無作用力，能快速通過色譜柱，產(chǎn)生尖峰。